20ul雙酶切體系和10ul雙酶切體系的區別

時間 2021-08-30 09:29:17

1樓:麼破1自我

20ul雙酶切體系和10ul雙酶切體系的區別:dna的量是3.5微升1、產物濃度不同

20ul雙酶切體系比10ul雙酶切體系產物的濃度高。

2、dna反應量不同

20ul雙酶切體系所含dna要比10ul雙酶切體系含有的dna多,進行雙酶切時所要切的dna量也不同。

研究中常用的雙酶切體系就是20ul雙酶切體系和10ul雙酶切體系,二者除了調配比例之外,所用的酶是相同的,所以反應溫度,酶切時間等等都差不多。

只有在需要**用於連線的時候才選取50ul體系的雙酶切體系,同時多增加dna含量。

2樓:

在進行pcr擴增時候,給引物兩端設計好酶切位點,一般說來,限制酶的 選擇非常重要,儘量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如bamhi,hindiii,提前看好各公司的雙切酶所用公用的buffer,以及各酶在公用buffer裡的效率。選好酶切位點後,在各個酶的兩邊加上保護鹼基。 雙酶切時間及其體系:

需要強調的是很多人建議酶切過夜,其實完全沒有必要,我一般酶切3個小時,其實1個小時已經足夠。應用大體系,如100微升。 純化問題:

純化pcr產物割膠還是柱式,我推薦柱式,因為割膠手法不準,很容易割下大塊的膠,影響純化效率。現在的柱式純化號稱可以祛除引物,既然如此,酶切掉的幾個鹼基肯定也會被純化掉了。所以,pcr產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。

我用的是takara的純化柱試劑盒 酶量的問題:以takara的為例,其對1單位酶的定義如下:在50 μl 反應液中,30℃溫度下反應1小時,將1 μg 的λdna完全分解的酶量定義為1個活性單位(u)。

而該酶濃度約為15單位/微升,在除外酶降解的 因素外,該酶可分解15μg的dna,而一般從1-4ml菌液提出的 dna約為3μg,而pcr純化後的產物(50體系)約為3μg,所以即便全部加進去,只要純化的 ***,酶切完全切得動。 2、酶切、**後的pcr產物與載體的連線 摩爾比的計算,很多人憑經驗也可以。但對於初學者從頭認真計算則 非常有必要。

**的載體片段:**的pcr產物片段=1:10 ,一般取前者0.

03pmol,後者取0.3pmol。 pmol為單位的dna轉換為為μg單位的dna:

(x pmoles×長度bp×650)/ 1,000,000 (注:長度bp×650是該雙鏈dna的分子量)所得數值即為μg,也可以直接用這個公式套.1pmol 1000bp dna=0.

66μg,如載體是5380bp,則0.03pmol為 0.03×5.

38×0.66=0.106524μg。

測dna濃度可以在專用機子上測,注意od值,一般約1.8-2.0.

另外,如果嫌麻煩,也可用marker進行估測,如marker2000,5微升的 marker每個條帶約50ng。 連線反應:takara的 連線酶上的 說明寫的過夜,而其對連線酶單位的定義為:

在20 μl的連線反應體系中,6 μg的λdna-hind iii的分解物在16℃下反應30分鐘時,有90%以上的dna段被連線所需要的酶量定義為1個活性單位(u)。而它的濃度為350 u/μl ,所以完全夠用。連線酶容易失活,注意低溫操作,最好在冰上。

時間3個小時足已。 3、轉化: a、全量(10 μl)加入至100 μl jm109感受態細胞中,冰中放置30分鐘。

b、42℃加熱90秒鐘後,再在冰中放置2分鐘。 c、加入890 μl amp陰性培養基,37℃振盪培養60分鐘。 取100μl鋪板。

也可離心後餘100μl 幾個非常重要的問題 1 做轉化的時候,進行酶連線反應時,注意保持低溫狀態,因為ligase酶很容易降解.為保險起見,一般連線3小時,16度. 2 對含有amp-resistence的質粒鋪板時,注意加amp時的溫度,溫度過高,會使克隆株無法篩選出來.

我的方法是培基高溫消毒後放在烤箱裡,烤箱一般溫度為55-60度,然後做的時候拿出來,這樣好掌握溫度。鋪板前後注意用吹風機吹乾 3對照的設立: 為驗證雙酶切是否成功,可做如下對照:

a 酶切反應時加各單酶分別切,兩管,用同一種buffer,跑膠,看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功. 做轉化時,也要進行對照.

設4個: a.即拿雙酶切的質粒產物也進行連線反應,這個對照可進一步看雙酶切是否成功,如果長出克隆,說明很有可能只進行了單酶切,如沒長出克隆,則證明雙酶切成功,當然要保證感受態,培基,連線酶都'正常'的情況下.

b.酶切過的未進行連線反應的雙酶切產物,進行轉化,這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質粒 c.設原始質粒為對照,意為檢測整個操作過程中是否有誤.

d.amp陰性板上用同一批感受態細胞鋪板20微升足夠,檢測感受態狀況. 4.

所有的試劑切記低溫儲存.一步一個腳印.不要偷懶,圖省事最後卻更費事.

注意設立對照。 經pcr鑑定,克隆90%-100%的陽性率,所以在後面的 挑克隆中,我只挑選4個就足夠了。然後雙酶切鑑定,測序。

3樓:用智慧為你解答

根據模板濃度啊 如果濃度太低 比如模板就得加10ul 那肯定要更大的體系 還有就是需要**的用大體系 菌p這種只是要看一下的用小體系

4樓:匿名使用者

1、**pcr產物: 在進行pcr擴增時候,給引物兩端設計好酶切位點,一般說來,限制酶的 選擇非常重要,儘量選擇粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如bamhi,hindiii,提前看好各公司的雙切酶所用公用的buffer,以及各酶在公用buffer裡的效率。選好酶切位點後,在各個酶的兩邊加上保護鹼基。

雙酶切時間及其體系:需要強調的是很多人建議酶切過夜,其實完全沒有必要,我一般酶切3個小時,其實1個小時已經足夠。應用大體系,如100微升。

純化問題:純化pcr產物割膠還是柱式,我推薦柱式,因為割膠手法不準,很容易割下大塊的膠,影響純化效率。現在的柱式純化號稱可以祛除引物,既然如此,酶切掉的幾個鹼基肯定也會被純化掉了。

所以,pcr產物和雙酶切產物的純化均可應用柱式純化。我用的是takara的純化柱試劑盒 酶量的問題:以takara的為例,其對1單位酶的定義如下:

在50 μl 反應液中,30℃溫度下反應1小時,將1 μg 的λdna完全分解的酶量定義為1個活性單位(u)。 而該酶濃度約為15單位/微升,在除外酶降解的 因素外,該酶可分解15μg的dna,而一般從1-4ml菌液提出的 dna約為3μg,而pcr純化後的產物(50體系)約為3μg,所以即便全部加進去,只要純化的 ***,酶切完全切得動。 2、酶切、**後的pcr產物與載體的連線 摩爾比的計算,很多人憑經驗也可以。

但對於初學者從頭認真計算則 非常有必要。**的載體片段:**的pcr產物片段=1:

10 ,一般取前者0.03pmol,後者取0.3pmol。

pmol為單位的dna轉換為為μg單位的dna:(x pmoles×長度bp×650)/ 1,000,000 (注:長度bp×650是該雙鏈dna的分子量)所得數值即為μg,也可以直接用這個公式套.

1pmol 1000bp dna=0.66μg,如載體是5380bp,則0.03pmol為 0.

03×5.38×0.66=0.

106524μg。 測dna濃度可以在專用機子上測,注意od值,一般約1.8-2.

0.另外,如果嫌麻煩,也可用marker進行估測,如marker2000,5微升的 marker每個條帶約50ng。 連線反應:

takara的 連線酶上的 說明寫的過夜,而其對連線酶單位的定義為:在20 μl的連線反應體系中,6 μg的λdna-hind iii的分解物在16℃下反應30分鐘時,有90%以上的dna段被連線所需要的酶量定義為1個活性單位(u)。而它的濃度為350 u/μl ,所以完全夠用。

連線酶容易失活,注意低溫操作,最好在冰上。時間3個小時足已。 3、轉化:

a、全量(10 μl)加入至100 μl jm109感受態細胞中,冰中放置30分鐘。 b、42℃加熱90秒鐘後,再在冰中放置2分鐘。 c、加入890 μl amp陰性培養基,37℃振盪培養60分鐘。

取100μl鋪板。也可離心後餘100μl 幾個非常重要的問題 1 做轉化的時候,進行酶連線反應時,注意保持低溫狀態,因為ligase酶很容易降解.為保險起見,一般連線3小時,16度.

2 對含有amp-resistence的質粒鋪板時,注意加amp時的溫度,溫度過高,會使克隆株無法篩選出來.我的方法是培基高溫消毒後放在烤箱裡,烤箱一般溫度為55-60度,然後做的時候拿出來,這樣好掌握溫度。鋪板前後注意用吹風機吹乾 3對照的設立:

為驗證雙酶切是否成功,可做如下對照: a 酶切反應時加各單酶分別切,兩管,用同一種buffer,跑膠,看單切的兩管是否成線性.如兩管均成線性可初步判斷雙酶切成功.

做轉化時,也要進行對照. 設4個: a.

即拿雙酶切的質粒產物也進行連線反應,這個對照可進一步看雙酶切是否成功,如果長出克隆,說明很有可能只進行了單酶切,如沒長出克隆,則證明雙酶切成功,當然要保證感受態,培基,連線酶都'正常'的情況下. b.酶切過的未進行連線反應的雙酶切產物,進行轉化,這一步可以證明是否有殘留的未被任何酶切的原始質粒 c.

設原始質粒為對照,意為檢測整個操作過程中是否有誤. d.amp陰性板上用同一批感受態細胞鋪板20微升足夠,檢測感受態狀況.

4.所有的試劑切記低溫儲存.一步一個腳印.

不要偷懶,圖省事最後卻更費事.注意設立對照。 經pcr鑑定,克隆90%-100%的陽性率,所以在後面的 挑克隆中,我只挑選4個就足夠了。

然後雙酶切鑑定,測序。

PCR產物和質粒雙酶切後電泳如何判斷酶切完成

35豆豆 pcr產物酶切後不能判斷是否完全.質粒如果切下來的片斷不是很小,可以取少量進行電泳檢視條帶.如果沒有完全酶切,大條帶會出現單酶切的產物條帶. 你是不是要把雙酶切後的質粒與載體連線,而無論是pcr還是載體都無法通過電泳判斷是否酶切完全,所以不好進行連線呀?對於pcr產物一般會採取這樣的策略,...