1樓：匿名使用者
原來擴增的時候就有兩條帶，**的時候（是凝膠**嗎？）可能因為產物濃度過大，導致兩條帶沒跑開，讓你一起切下來了（**後電泳檢測了沒？），所以連線後有兩種克隆。
至於說為什麼會出現兩種克隆，要具體問題具體分析咯。
1 可能你的模板有dna汙染，所以同時擴出了dna的帶和cdna的帶；
2 你的基因發生了選擇性剪接，有多條成熟的mrna序列；
3 該基因有一個家族，而你的兩條引物分別在兩個保守區；
4 引物不特異，或者擴增溫度太低。
5 你的片斷匯入到細菌後發生重組了，這種情況在一些長得快的大腸桿菌中有發生，不過要當你完全排除上面出現的情況時，再考慮這種情況。
2樓：燈下草蟲
你的引物比較長吧，不是雜帶，是引物聚合體。沒事的，結果正常。這種東西哪有什麼文獻好引的，最底層的實驗結果。
菌液pcr的時候能p出目的條帶，為什麼測序卻完全不正確
3樓：v永遠拼搏
有可能是引物特異性不好或者細菌細胞雜質所帶來的假陽性～得到的條帶有可能是混合的～建議測序分析模板用提取的核酸做模板……若還是不對 請重新設計引物 或採用巢式pcr
菌液pcr檢測目的條帶很明顯但是有弱雜帶是怎麼回事
4樓：匿名使用者
簡單來說bai是非特異性擴增，一個pcr反反du應體系的zhi
是有限的，大多數引物用dao於擴增目的回基因，匹配度高答
，容易結合，因此擴增快，條帶也就亮。而非特異擴增，匹配度不高，給合不穩定，因此擴出來的非特異帶顯得弱，而且通過有多條弱帶產生。
5樓：匿名使用者
非單克隆 或者引物可以從載體上p出部分片段
6樓：匿名使用者
建議：迴圈次數減少3，mg離子濃度降低到1.2mm，提高annealing的溫度
菌液pcr沒東西，但是提完質粒能跑出來條帶，為什麼
7樓：萇甲
首先確保實驗環節沒有問題。
接下來需要分析菌液pcr採用什麼樣的引物？特異性引物還是通用引物？初步懷疑你用的應該是特異性引物，不是通用引物。
實驗中多用載體兩端的通用引物進行pcr驗證，擴增產物鹼基數目大於目的片段鹼基數目。確定菌液pcr陽性對照（即攜帶空載體的菌液，為了簡便實驗，有時候也可以用空載體直接做模板）正確無誤，那麼檢測樣品結果中沒有條帶的話則均為陰性。
提取出來的質粒可能是空載體質粒，你可以做一下酶切實驗驗證一下，如果酶切位點允許的話最好做一下雙酶切，同時加空載體雙酶切作對照，這樣結果一目瞭然。
【求助】菌落pcr有目的條帶與菌液pcr卻什麼都沒有？
8樓：猴拙嘉
高手們好。最近做酶切連線轉化，最後做鑑定時，以菌落為模板進行pcr時可以見到有目的條帶；當把菌落接種到lb液擴菌後，以菌液為模板進行pcr時卻什麼東東都沒有？請問會是什麼原因啊?
多多指教啊！建議重新以菌落為模板進行pcr檢測，再重新以菌液為模板進行pcr檢測，因為菌落或者菌液pcr假陽性的機率還是比較高的。但如果還是出現以上結果，推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的，此時建議再提質粒做pcr檢測和酶切檢測來徹底證明你的目的片段是否真正與載體連線成功。
個人的見解希望對你有所幫助，也期望高手們批評指正！我覺得菌落pcr效果很好，雖然有假陽性的可能，但是只要是做出來，有目的條帶一般是對的，你為什麼還要用菌液做pcr？你還不如搖菌後提取質粒然後用質粒pcr或者酶切。
既然你說到這個問題了，我覺得很有可能是你的質粒被稀釋了，因為在菌落中的濃度比較大。另外也有可能是你根本就沒有挑到正確的菌落來搖菌，所以就沒有質粒，怎麼能做出來。我覺得你做菌液的pcr和菌液的pcr必須是從單一的一個菌落挑出來的，如果不是，那肯定只有一個是正確的，我做過，只要是同一菌落不會有差錯。
你再試試看，祝你成功！謝謝各位高手的及時的回答。現在我都是挑單個菌落後搖菌，然後提取質粒，然後以質粒為模板做pcr，陽性的質粒再酶切進行鑑定，效果還可以。
再次謝謝大家！！！第二次看到這種觀點，不確定對不對，借道跟大家討論一下，不知道lcc有沒有文獻支援一下這種觀點？如果這種觀點正確，那我以前很多關於t載體的看法就錯了，所以很感興趣。
我一直以為外面的dn**段會被大腸桿菌分泌出來的核酸酶降解。
lcc_0 wrote:推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的說來也很奇怪，以前我就是挑菌後加到lb液後搖菌，然後以菌液為模板進行pcr，再以陽性管提取質粒進行酶切鑑定，排除陰性管，這樣可以少提一些質粒。最近菌液pcr總是陰性，所以就直接提質粒進行鑑定了。
其中原因真的不知道是什麼？我也遇到過，也許是塗抹的轉化產物導致的加陽性（菌落pcr）。各位大大，我倒是碰到過菌液pcr是陰性，但是有質粒的情況，酶切也正確。
一般我以為質粒抽屜和酶切鑑定是最保險的。pcr假陽性。假陰性的概率都很高。
菌液的問題在於鹽！鹽會干擾pcr。 如果用菌液的話，可以用水洗滌離心幾次，然後重懸於水，就可以了。
題外話：最近菌落pcr，陰性和陽性對照經常不擴增，而樣品擴增，鬱悶啊。
菌液pcr有條帶，但提不出質粒，為什麼？
9樓：百里屠蘇
同樣的問題來
，我也正經歷著自，彆著急慢慢分析原因。
如果你bai做得是du質粒的構建，
zhi我想根本的原因是沒有連線上，那dao得重新做，考慮連線的問題。
對於你的那個5天得菌液，原則上說菌液放久了，質粒可能會丟失，你可以重新再在抗性培養基裡（如果有抗性的話）搖一下。如果沒連線好的話估計也提不出質粒。
慢慢來，共勉！
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