雙抗夾心ELISa的步驟是什麼,ELISA中雙抗體夾心法與間接法的區別在哪

時間 2021-08-30 10:59:03

1樓:藍般若戀

elisa操作步驟(雙抗體夾心法)

1. 包被過程(注意設定空白對照,陰性對照):

將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當濃度,每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;棄去孔中液體,(為避免蒸發,板上應加蓋或將板平放在底部有溼紗布的金屬溼盒中)。

2.pbs洗3次,每次3分鐘。

具體為:吸乾或甩幹孔內反應液;用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注板孔後,即甩去);浸泡,即將洗滌液注滿板孔,放置1-2分鐘,間歇搖動,浸泡時間不可隨意縮短;吸乾孔內液體,可甩去液體後在清潔毛巾或吸水紙上拍幹;重複操作滌3次。

3. 加入待檢測樣品(建立合適的濃度梯度):

檢測時一般採用1:50-1:400的稀釋度, 應採用較大稀釋體積進行,一般保證樣品吸取量》20μl。

將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中,每樣品至少加雙孔,每孔100μl,置於37℃,40-60min。

4 .pbs洗3次,每次3分鐘。

5. 加入酶標抗體:

酶標抗體:根據酶結合物提供商提供的參考稀釋度進行或建立濃度梯度,37℃30-60min之間,短於30min往往結果不穩定,每孔加100μl。

6 .pbs洗3次,每次3分鐘。

7. 加入底物液(現用現配):

tmb(四甲基聯苯胺)使用液:tmb(10mg/5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩衝液(ph5.

5)10ml0.75%h2o232μl,底物加入量每孔100μl(tmb空白顯色孔除外),置37℃避光放置20-25分鐘。

8. 終止反應:

每孔加入終止液50μl(2m h2so4)終止反應, 此時藍色立轉黃色,於20min內測實驗結果。

9.結果判斷:

可於白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺。也可測吸光值:

在elisa檢測儀上,tmb反應產物檢測需要450nm波長,檢測時一定要首先進行空白孔系統調零。用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值(p/n)表示,當p/n大於2時作為抗體的效價即大於陰性對照吸光值的2倍,(數值的大小依具體檢測要求而定)。

2樓:匿名使用者

(1)單抗包被-抗原-酶標二抗-底物顯色。

本法首先也是用特異性抗體包被於固相載體,經洗滌後加入含有抗原之待測樣品,如待檢樣品中有相應抗原存在,即可與包被於固相載體上的特異性抗體結合,經保溫孵育洗滌後,即可加入酶標記特異性抗體,再經孵育洗滌後,加底物顯色進行測定,底物降解的量即為欲測抗原的量。

(2)單抗包被-抗原-二抗-酶標二抗-底物顯色。(改良雙抗體夾心法)本法首先是將特異性抗體a包被於固相載體,經洗滌加入含有欲測抗原之待檢樣品。經孵育洗滌後再加一次未標記的特異性抗體b,而這次加入的抗體b於第一次包被於固相載體上的特異性抗體a對被測抗原來說都是特異性的,但不是用同種動物免疫製備的,否則可出現非特異性反應。

經孵育洗滌後,再加酶標記抗b抗體,再經孵育洗滌後加底物顯色進行測定。這種方法與雙抗體夾心法不同之處是多加了一層抗體。因此,放大的倍數更高,故比雙抗體夾心法更加靈敏。

同時避免標記特異性抗體,而另一優點是隻要標記一種抗抗體,即可達到多種應用。

3樓:匿名使用者

你說的是雙抗體夾心法吧!它是用來測抗原的!例如測乙肝病毒的表面抗原,如果陽性可以說明得乙肝了!步驟: 1.平衡20min(把需要的東西準備好,保證實驗

4樓:匿名使用者

雙抗體夾心的意思是包被抗體-檢測抗原-酶標抗體形成夾心結構。

至於是單抗或者多抗都可以。

如果是酶標二抗(二抗就是抗抗體)的話,一般是包被抗原-抗體-酶標二抗,這種是間接法的

elisa中雙抗體夾心法與間接法的區別在哪

5樓:南京金益柏生物科技****

雙抗體夾心法:

(1) 包被:用0.05m ph9.

牰碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃過夜。

次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩衝液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。

(2) 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。

(3) 加酶標抗體:於各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定後的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時,洗滌。

(4) 加底物液顯色:於各反應孔中加入臨時配製的tmb底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘。

(5) 終止反應:於各反應孔中加入2m硫酸0.05ml。

(6) 結果判定:可於白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以「+」、「-」號表示。

也可測o·d值:在elisa檢測儀上,於450nm(若以abts顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零後測各孔o·d值,若大於規定的陰性對照od值的2.1倍,即為陽性。

間接法:

用包被緩衝液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜。次日洗滌3次。

加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)於反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.

1ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,最後一遍用ddw洗滌。其餘步驟同「雙抗體夾心法」的4、5、6。

雙抗夾心法制備elisa試劑盒時。怎麼確定包被用抗體濃度?

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