細胞轉染了gfp固定後還能發熒光嗎

1樓：匿名使用者

細胞轉染gfp質粒並進行表達之後，一般細胞內會有大量的gfp蛋白，可以發出綠色熒光。

gfp發出綠色熒光的原理是ca離子進入gfp的beta-barrel結構中引起的特定能級，因此只要這個結構仍然保持著，就可以發出熒光。

由於gfp的beta-barrel結構非常穩定，一些版本的gfp蛋白（如egfp）甚至能抵抗94c的高溫幾分鐘而不完全變性，因此想在溶液狀態下去掉gfp的熒光是很難的，一般需要用光漂白法。

基於其非常穩定的結構，即便細胞被固定了，仍然會有一部分的gfp蛋白保持其構象而發出熒光。此時熒光可能較弱。在熒光顯微鏡下是有可能看得到的。

2樓：創作者

現提供一些gfp資料

1.1.gfp和egfp

1.1.1.

結構至今只有水母中的gfp基因被克隆。水母中的gfp由238個氨基酸組成，分子量為27kd。野生型gfp被紫外和藍光激發後，能發出綠色熒光 [1]。

野生型gfp有一些特點，如熒光較弱、易受溫度影響、產生熒光過程滯後等。目前，已有多種gfp的突變體問世[2]。這些突變體螢光增強、蛋白摺疊效率增加，如目前常用的egfp，其發光強度比野生型gfp高35倍[3]。

1.1.2.

特點　gfp最大的特點是不需要底物或輔因子，可對活體檢測,因而可對被標記物件進行動態、連續的觀察。①體積小　只有lac z的1/5,表達無種屬限制。②熒光表達穩定　即使是在甲醛或戊二醛固定的標本中，gfp的熒光仍能保持穩定。

③不僅可與其它標記物，也可用不同突變體同時進行多種標記。④檢測方便　常用熒光顯微鏡,鐳射掃描共聚焦顯微鏡觀測。⑤無放大作用　因而很多情況下需要強啟動子。

1.1.3.

應用 ①標記基因　由於gfp諸多優點,越來越多的人傾向於用它代替傳統的分子標記物。②熒光動物模型　用強啟動子讓gfp在轉基因動物全身表達,就形成了綠色熒光動物模型。這類模型不僅提供有gfp標記的各種細胞、組織、器官,還可做為器官移植實驗的動物模型。

轉染細胞後對照組gfp熒光比實驗組亮怎麼回事

3樓：匿名使用者

轉染了gfp的細胞不能用fitc標記的annexin v,因為fitc和gfp在流式細胞儀上是同一通道檢測,無法區分,必須選用其他熒光素標記的annexin v,比如apc、pe等.bd的凋亡檢測試劑盒不錯.

轉染後用熒光顯微鏡觀察細胞是否有熒光出現在

4樓：進擊的小站長

我最近常做這個實驗，gfp也在n端，與目的蛋白融合表達，我對cos-1轉染該融合片段的感想總結如下：

1）轉染細胞狀態一定要好，這是成敗的關鍵。我選擇的是早晨消化cos，分瓶密度高，下午即在60%滿時，就轉染1-2ugdna，6hr換液用低血清（1%fbs）dmem維持

2）gfp-目的蛋白由於cmv啟動子問題，表達效率太高，對細胞的正常狀態不利，尤其是細胞狀態不好的細胞。所以常有細胞漂浮起來、凋亡的現象，看熒光時，可以將細胞上清洗滌後觀察。

3）根據不同蛋白的性質決定的，有的蛋白具有nes、nls或跨膜區、訊號肽等功能性序列，可能將gfp帶到胞外

4）細胞的性質決定gfp位置：如cos細胞，常形成液泡，佔據大量胞漿，gfp有時會沿著這種胞液分佈，要選擇高倍鏡觀察

5）觀察要仔細，選擇可見光和高倍數熒光看

祝您成功！