細胞轉染了gfp固定後還能發熒光嗎

時間 2021-09-04 06:45:26

1樓:匿名使用者

細胞轉染gfp質粒並進行表達之後,一般細胞內會有大量的gfp蛋白,可以發出綠色熒光。

gfp發出綠色熒光的原理是ca離子進入gfp的beta-barrel結構中引起的特定能級,因此只要這個結構仍然保持著,就可以發出熒光。

由於gfp的beta-barrel結構非常穩定,一些版本的gfp蛋白(如egfp)甚至能抵抗94c的高溫幾分鐘而不完全變性,因此想在溶液狀態下去掉gfp的熒光是很難的,一般需要用光漂白法。

基於其非常穩定的結構,即便細胞被固定了,仍然會有一部分的gfp蛋白保持其構象而發出熒光。此時熒光可能較弱。在熒光顯微鏡下是有可能看得到的。

2樓:創作者

現提供一些gfp資料

1.1.gfp和egfp

1.1.1.

結構 至今只有水母中的gfp基因被克隆。水母中的gfp由238個氨基酸組成,分子量為27kd。野生型gfp被紫外和藍光激發後,能發出綠色熒光 [1]。

野生型gfp有一些特點,如熒光較弱、易受溫度影響、產生熒光過程滯後等。目前,已有多種gfp的突變體問世[2]。這些突變體螢光增強、蛋白摺疊效率增加,如目前常用的egfp,其發光強度比野生型gfp高35倍[3]。

1.1.2.

特點 gfp最大的特點是不需要底物或輔因子,可對活體檢測,因而可對被標記物件進行動態、連續的觀察。①體積小 只有lac z的1/5,表達無種屬限制。②熒光表達穩定 即使是在甲醛或戊二醛固定的標本中,gfp的熒光仍能保持穩定。

③不僅可與其它標記物,也可用不同突變體同時進行多種標記。④檢測方便 常用熒光顯微鏡,鐳射掃描共聚焦顯微鏡觀測。⑤無放大作用 因而很多情況下需要強啟動子。

1.1.3.

應用 ①標記基因 由於gfp諸多優點,越來越多的人傾向於用它代替傳統的分子標記物。②熒光動物模型 用強啟動子讓gfp在轉基因動物全身表達,就形成了綠色熒光動物模型。這類模型不僅提供有gfp標記的各種細胞、組織、器官,還可做為器官移植實驗的動物模型。

轉染細胞後對照組gfp熒光比實驗組亮怎麼回事

3樓:匿名使用者

轉染了gfp的細胞不能用fitc標記的annexin v,因為fitc和gfp在流式細胞儀上是同一通道檢測,無法區分,必須選用其他熒光素標記的annexin v,比如apc、pe等.bd的凋亡檢測試劑盒不錯.

轉染 後用熒光顯微鏡觀察細胞是否有熒光出現 在

4樓:進擊的小站長

我最近常做這個實驗,gfp也在n端,與目的蛋白融合表達,我對cos-1轉染該融合片段的感想總結如下:

1)轉染細胞狀態一定要好,這是成敗的關鍵。我選擇的是早晨消化cos,分瓶密度高,下午即在60%滿時,就轉染1-2ugdna,6hr換液用低血清(1%fbs)dmem維持

2)gfp-目的蛋白由於cmv啟動子問題,表達效率太高,對細胞的正常狀態不利,尤其是細胞狀態不好的細胞。所以常有細胞漂浮起來、凋亡的現象,看熒光時,可以將細胞上清洗滌後觀察。

3)根據不同蛋白的性質決定的,有的蛋白具有nes、nls或跨膜區、訊號肽等功能性序列,可能將gfp帶到胞外

4)細胞的性質決定gfp位置:如cos細胞,常形成液泡,佔據大量胞漿,gfp有時會沿著這種胞液分佈,要選擇高倍鏡觀察

5)觀察要仔細,選擇可見光和高倍數熒光看

祝您成功!

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