PCR反應中Taq酶最適溫度為75度,為什麼把儀器設為72度

時間 2021-08-30 10:55:19

1樓:匿名使用者

大概是酶的種類不一樣吧。寡核苷酸引物的延伸應該在最適溫度下進行,對於taq酶來說最適溫度一般為72-78度。但過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。

我們用的也是72度,酶是黃石公園mushroom spring的嗜熱水生菌(t.aguaticus)的taq。

程式是94度4.5分預變性,94度30秒denature,55度1分aneal,72度1分extension(迴圈)72度5分結束。

---------------------------------------------

隨著分子生物學研究發展的不斷廣泛和深入,pcr已成為一門相當成熟的常規技術,而熱聚合酶(即taq酶)的合理選擇是pcr成敗與否的一個關鍵因素。目前市面上有多種taq酶,能夠滿足多方面的實驗需要。那麼,如何選擇最合適的taq酶?

根據使用者經常考慮的指標,如特異性、保真性、耐熱性、擴增速率、擴增片段長度、能否進行復雜模板擴增以及優化條件難易等等,我們在這兒將主要的taq酶歸歸類,其性質、用途也就一目瞭然了。

高特異性taq酶

高度特異性地擴增所需的片段是pcr最基本的要求,影響pcr特異性的因素很多,包括模板、引物性質及質量、反應條件的控制等等,而高特異性taq酶的出現大大減少了摸條件這一繁瑣的實驗過程,也為pcr產物快速有效的純化(pcr產物直接純化)打下了基礎。這類酶最典型的代表是熱啟動taq酶。大家都知道,在pcr第一個迴圈變性之前,有一個升溫的過程,引物和模板會有一些非特異性配對,如果這時taq酶發揮活性,就很容易產生非特異性擴增,由於迴圈初期模板量非常少,產生的非特異性條帶經過後面的指數擴增,就會嚴重干擾目的片段的擴增,甚至導致特異性條帶不能擴出。

而熱啟動taq酶是必需經過高溫才能啟用的酶,因此在初始迴圈的變性之前它沒有活性,不會產生非特異性擴增,這就大大提高了pcr擴增的特異性。第一代熱啟動taq酶往往直接在taq酶上做一些修飾,比如用抗體抑制,蠟封等,如clontech、stratagen、gibcol-lti的一些產品,由於抗體、蠟等異物的摻入,對實驗造成一定的影響,也給試驗者帶來一些不便。新一代的熱啟動taq酶是通過內部改造的重組酶,真正實現便利的熱啟動,代表產品如qiagen公司的hotstar系列,無需別的輔助抑制物,也不用擔心抑制不穩定,使用起來方便、高效。

此外,由於幾乎所有的taq酶產品都帶有相應的反應緩衝液,緩衝液的品質也對保證taq酶特異性擴增起著不可忽視的作用,一般的緩衝液中調節h鍵作用的鹽只有kcl,qiagen公司的緩衝體系通過kcl、(nh4)so4鹽離子體系的平衡調節也提高了酶作用的特異性。

此外,熱啟動的taq酶也是實現一步法rt-pcr的基礎。如qiagen公司的onestep rt-pcr試劑盒,在rt反應較低溫度下,taq酶沒有活性,逆轉錄酶發揮活性;rt反應結束,高溫滅活逆轉錄酶的同時,啟用taq酶,進行pcr反應。另一家公司epicentre有一種masteramptm tth dna聚合酶,本身就具有逆轉錄酶活性,也可用作rt-pcr。

高保真taq酶

下游應用為基因篩選、測序、突變檢測,分子診斷等等的使用者,往往對pcr保真性要求很高,保真性的一個通用標準是錯配率,錯配率越低保真性越好。普通taq酶的錯配率在2-5x10-5鹼基/迴圈數,而高保真taq酶錯配率可達10-6數量級,大大降低了出錯的可能。其原理主要是因為高保真taq酶具有3'到5'核酸外切酶(proofreading)的活性,擴增途中如果產生了錯配的鹼基,它可以將其切掉,從而保證了擴增的準確性。

需要提醒使用者的是由於此酶具有核酸外切酶功能,往往擴增效率低一些,有的還容易降解引物,且產物一般不宜用ta或ua克隆法克隆。目前市面上主要有兩類產品,一類是混合型的高保真酶,將帶有proofreading活性的酶與普通taq酶(用於提高擴增效率)混合起來,錯配率在8-9 x10-6鹼基/迴圈數。clontech、lti等公司都有此類產品。

如果要求更高的保真度,就要選擇單一型的高保真酶,如stratagene的pfu,neb公司的vent dna 聚合酶,錯配率5.7 x10-5鹼基/迴圈數;qiagen公司新推出的proofstart dna聚合酶,兼特異性與保真性於一體,其聚合酶及proofreading活性都為熱啟動,可避免引物降解,錯配率達2-4×10-6鹼基/迴圈數,加上優化的反應體系,可在室溫下配置反應液,可進行復雜模板(高gc含量、二級結構)及長片段的擴增,的確是這類酶中的佼佼者。

高耐熱性taq酶

對於有些模板變性溫度較高,需要時間較長的使用者,可能要求高耐熱性taq酶,這裡介紹neb公司的vent和deep vent dna聚合酶系列,兩者都是從海底火山口分離出來後克隆的,是普通taq酶耐熱性的三倍以上,前者在95°c半衰期近7小時,100°c近2小時;後者更甚,分別為23小時和8小時。

超長片段擴增taq酶

對於作基因**譜、測序及分子遺傳學研究的使用者,可能會用到超長片段的擴增,clontech公司的advantage genomic系列混有tth dna聚合酶,proofreading酶和熱啟動抗體,對複雜模板可擴增10kb片段,簡單模板可達40kb。

關於複雜模板的擴增

對於模板結構複雜,如gc含量高(>60%),有二級結構等,普通的taq酶可能難以延伸下去,加入dmso等助熔劑可幫助擴增順利進行,但dmso有毒,而且用量需要優化。qiagen公司的任何一種taq酶都附有特製的q-溶液,操作方便、安全,對複雜模板的擴增特別有效。

關於條件的優化

現下很多著名的生物試劑公司都提供優化的緩衝液,如qiagen公司的緩衝體系,對溫度和mg2+的耐受性很強,隨試劑盒有推薦的操作手冊,大大減少了反應條件的優化,如果結合好的引物設計軟體和高質量的模板引物,一次成功率極高。但任何東西都不是萬能的,如果碰到比較特殊的情況,還需要仔細分析,優化調整。

以上就taq酶的一些基本分類分別進行了介紹,具體選購時要根據實驗需要擇其重點,再參照其他引數,才能選到最合適的taq酶。我們會及時將最新的技術和產品推薦給大家,希望能幫助大家更快更好的達到實驗目的。

2樓:

其實雖然tap酶的最適溫度在75度,但處於這個溫度下酶失活的速度也較72度要快,而72度時,酶的活力與75度相比雖有下降,但對最終結果影響不大

而且溫度高,不利於引物和模板的結合,也不利於合成出的dna鏈與模板結合。

個人理解,僅供參考。

pcr反應過程中94℃與72℃之間反應體系發生著什麼反應,72℃與55℃之間又發生著什麼反應?

3樓:匿名使用者

在94度時,所有雙鏈都是解離狀態,自由碰撞。由於溫度過高,及時互補鏈相遇,也無法形成氫鍵。

當溫度向55度降低時,互補鍊形成氫鍵的機率逐漸增大,由於引物的濃度大大超過以擴增的互補鏈,所以引物和互補鏈的結合開始增多,溫度降低到引物的tm溫度時,理論上已經有一般的互補鏈已經和引物結合了。降到55度時,結合基本完成,taq酶也到位。

溫度升到72度後,taq獲得最適溫度,活性增高,開始合成新鏈。再次升高溫度時,根據模板的長短,如果是原始的模板,taq酶還正在合成新鏈,合成被打斷。如果模板是新合成的,比較短,這時taq已經到了新合成連的末端,並且給末端加了個核苷酸-a.

這個也就是為什麼pcr產物其實是粘性末端:

************-a

a-************

上面一條是5『-3』,下面是互補 (示意圖)

4樓:匿名使用者

94度是變性溫度,在這個溫度下dna雙鏈開啟,72度是延伸溫度,這個溫度是dna聚合酶進行延伸的溫度,不一定延伸溫度都是72度,不同**的聚合酶延伸溫度不同,這兩個溫度基本都是由使用的聚合酶決定的,55度是退火溫度,是由你設計的引物決定的,在這個溫度下你的引物可以跟模版鏈特異性結合,一圈完整的pcr反應應該是94度變性,dna雙鏈開啟,55度退火,上下游引物分別與你的模板鏈特異性結合,最後是72度延伸,以模板鏈為複製模板,按照5'到3'的方向從引物的3'端開始往後延伸

5樓:

94℃時dna雙鏈發生解鏈,55℃時引物與模板dna鏈結合,72℃時結合了模板鏈的引物以其互補鏈為模板進行延伸。

之間是什麼意思?指降溫的過程?降溫是在很短的時間內完成的,中間的反應幾乎可以忽略不計。

影響pcr反應效率的因素有哪些?如何有效地提高pcr反應的效率?

6樓:閉曄旅爾容

一、溫度迴圈引數

二、引物引物設計

三、dna聚合酶

四、mg2+

如何確定pcr反應中的退火溫度和延長時間

7樓:禾鳥

1、退火溫度低於引物tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。

退火溫度需要從多方面去決定,一般根據引物的tm值(tm值=4(g+c) +2(a+t))為參考,根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。

引物延伸一般在72℃進行(taq酶最適溫度)。但在擴增長度較短且退火溫度較高時,本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定,一般推薦在1000bp以上,含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

擴充套件資料

pcr的過程:

1、dna變性:(90℃-96℃):雙鏈dna模板在熱作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈dna

2、退火:(60℃-65℃):系統溫度降低,引物與dna模板結合,形成區域性雙鏈。

3、延伸:(70℃-75℃):在taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dntp為原料,從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸,合成與模板互補的dna鏈。

8樓:匿名使用者

退火溫度一般是比你設計引物時的tm值低5度。不過這是要摸索的,用溫度梯度pcr。(順便說一下,如果你不想花時間摸索溫度,建議就用60度。

這個溫度是我原來做實驗時的萬能溫度。尤其對較短片段pcr適用)

延長時間是看pcr產物長度,一般認為常規taq酶一分鐘擴增1kb。比如你的pcr產物是500bp,你就用30秒。不過我一般會在這個基礎上再加5秒左右。

求PCR(聚合酶鏈式反應)的英文介紹或綜述

給一篇免費英文綜述連結,關於polymerase chain reaction的,希望能夠對你有所幫助 求pcr 多聚合酶鏈反應技術 發展史!有文獻的砸上來幫下忙。 i think it is good.and it is better.pcr技術 王霄鵬 推薦 慄瑞豐 請參見連結 希望能夠對你有所...

PCR產物和質粒雙酶切後電泳如何判斷酶切完成

35豆豆 pcr產物酶切後不能判斷是否完全.質粒如果切下來的片斷不是很小,可以取少量進行電泳檢視條帶.如果沒有完全酶切,大條帶會出現單酶切的產物條帶. 你是不是要把雙酶切後的質粒與載體連線,而無論是pcr還是載體都無法通過電泳判斷是否酶切完全,所以不好進行連線呀?對於pcr產物一般會採取這樣的策略,...

PCR技術中為什麼不用解旋酶,PCR技術中為什麼不用解旋酶

原因如下 1 解旋酶一般只能開啟很短一部分的dna雙螺旋,在具體pcr操作的時候無法控制其具體在什麼時間。2 不能保證dna解旋酶解開dna的那段時間足夠長以便讓引物和模板結合,而且引物和模板結合後,解旋酶還能立刻移開以免阻礙dna合成酶的前進。聚合酶鏈式反應為一種用於放大擴增特定的dn 段的分子生...