1樓：匿名使用者
大概是酶的種類不一樣吧。寡核苷酸引物的延伸應該在最適溫度下進行,對於taq酶來說最適溫度一般為72-78度。但過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。
我們用的也是72度，酶是黃石公園mushroom spring的嗜熱水生菌（t.aguaticus）的taq。
程式是94度4.5分預變性，94度30秒denature，55度1分aneal，72度1分extension（迴圈）72度5分結束。
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隨著分子生物學研究發展的不斷廣泛和深入，pcr已成為一門相當成熟的常規技術，而熱聚合酶（即taq酶）的合理選擇是pcr成敗與否的一個關鍵因素。目前市面上有多種taq酶，能夠滿足多方面的實驗需要。那麼，如何選擇最合適的taq酶？
根據使用者經常考慮的指標，如特異性、保真性、耐熱性、擴增速率、擴增片段長度、能否進行復雜模板擴增以及優化條件難易等等，我們在這兒將主要的taq酶歸歸類，其性質、用途也就一目瞭然了。
高特異性taq酶
高度特異性地擴增所需的片段是pcr最基本的要求，影響pcr特異性的因素很多，包括模板、引物性質及質量、反應條件的控制等等，而高特異性taq酶的出現大大減少了摸條件這一繁瑣的實驗過程，也為pcr產物快速有效的純化（pcr產物直接純化）打下了基礎。這類酶最典型的代表是熱啟動taq酶。大家都知道，在pcr第一個迴圈變性之前，有一個升溫的過程，引物和模板會有一些非特異性配對，如果這時taq酶發揮活性，就很容易產生非特異性擴增，由於迴圈初期模板量非常少，產生的非特異性條帶經過後面的指數擴增，就會嚴重干擾目的片段的擴增，甚至導致特異性條帶不能擴出。
而熱啟動taq酶是必需經過高溫才能啟用的酶，因此在初始迴圈的變性之前它沒有活性，不會產生非特異性擴增，這就大大提高了pcr擴增的特異性。第一代熱啟動taq酶往往直接在taq酶上做一些修飾，比如用抗體抑制，蠟封等，如clontech、stratagen、gibcol-lti的一些產品，由於抗體、蠟等異物的摻入，對實驗造成一定的影響，也給試驗者帶來一些不便。新一代的熱啟動taq酶是通過內部改造的重組酶，真正實現便利的熱啟動，代表產品如qiagen公司的hotstar系列，無需別的輔助抑制物，也不用擔心抑制不穩定，使用起來方便、高效。
此外，由於幾乎所有的taq酶產品都帶有相應的反應緩衝液，緩衝液的品質也對保證taq酶特異性擴增起著不可忽視的作用，一般的緩衝液中調節h鍵作用的鹽只有kcl，qiagen公司的緩衝體系通過kcl、(nh4)so4鹽離子體系的平衡調節也提高了酶作用的特異性。
此外，熱啟動的taq酶也是實現一步法rt-pcr的基礎。如qiagen公司的onestep rt-pcr試劑盒，在rt反應較低溫度下，taq酶沒有活性，逆轉錄酶發揮活性；rt反應結束，高溫滅活逆轉錄酶的同時，啟用taq酶，進行pcr反應。另一家公司epicentre有一種masteramptm tth dna聚合酶，本身就具有逆轉錄酶活性，也可用作rt-pcr。
高保真taq酶
下游應用為基因篩選、測序、突變檢測，分子診斷等等的使用者，往往對pcr保真性要求很高，保真性的一個通用標準是錯配率，錯配率越低保真性越好。普通taq酶的錯配率在2-5x10-5鹼基/迴圈數，而高保真taq酶錯配率可達10-6數量級，大大降低了出錯的可能。其原理主要是因為高保真taq酶具有3'到5'核酸外切酶（proofreading）的活性，擴增途中如果產生了錯配的鹼基，它可以將其切掉，從而保證了擴增的準確性。
需要提醒使用者的是由於此酶具有核酸外切酶功能，往往擴增效率低一些，有的還容易降解引物，且產物一般不宜用ta或ua克隆法克隆。目前市面上主要有兩類產品，一類是混合型的高保真酶，將帶有proofreading活性的酶與普通taq酶（用於提高擴增效率）混合起來，錯配率在8-9 x10-6鹼基/迴圈數。clontech、lti等公司都有此類產品。
如果要求更高的保真度，就要選擇單一型的高保真酶，如stratagene的pfu，neb公司的vent dna 聚合酶，錯配率5.7 x10-5鹼基/迴圈數；qiagen公司新推出的proofstart dna聚合酶，兼特異性與保真性於一體，其聚合酶及proofreading活性都為熱啟動，可避免引物降解，錯配率達2-4×10-6鹼基/迴圈數，加上優化的反應體系，可在室溫下配置反應液，可進行復雜模板（高gc含量、二級結構）及長片段的擴增，的確是這類酶中的佼佼者。
高耐熱性taq酶
對於有些模板變性溫度較高，需要時間較長的使用者，可能要求高耐熱性taq酶，這裡介紹neb公司的vent和deep vent dna聚合酶系列，兩者都是從海底火山口分離出來後克隆的，是普通taq酶耐熱性的三倍以上，前者在95°c半衰期近7小時，100°c近2小時；後者更甚，分別為23小時和8小時。
超長片段擴增taq酶
對於作基因**譜、測序及分子遺傳學研究的使用者，可能會用到超長片段的擴增，clontech公司的advantage genomic系列混有tth dna聚合酶，proofreading酶和熱啟動抗體，對複雜模板可擴增10kb片段，簡單模板可達40kb。
關於複雜模板的擴增
對於模板結構複雜，如gc含量高（>60%），有二級結構等，普通的taq酶可能難以延伸下去，加入dmso等助熔劑可幫助擴增順利進行，但dmso有毒，而且用量需要優化。qiagen公司的任何一種taq酶都附有特製的q-溶液，操作方便、安全，對複雜模板的擴增特別有效。
關於條件的優化
現下很多著名的生物試劑公司都提供優化的緩衝液，如qiagen公司的緩衝體系，對溫度和mg2+的耐受性很強，隨試劑盒有推薦的操作手冊，大大減少了反應條件的優化，如果結合好的引物設計軟體和高質量的模板引物，一次成功率極高。但任何東西都不是萬能的，如果碰到比較特殊的情況，還需要仔細分析，優化調整。
以上就taq酶的一些基本分類分別進行了介紹，具體選購時要根據實驗需要擇其重點，再參照其他引數，才能選到最合適的taq酶。我們會及時將最新的技術和產品推薦給大家，希望能幫助大家更快更好的達到實驗目的。
2樓：
其實雖然tap酶的最適溫度在75度，但處於這個溫度下酶失活的速度也較72度要快，而72度時，酶的活力與75度相比雖有下降，但對最終結果影響不大
而且溫度高，不利於引物和模板的結合，也不利於合成出的dna鏈與模板結合。
個人理解，僅供參考。
pcr反應過程中94℃與72℃之間反應體系發生著什麼反應，72℃與55℃之間又發生著什麼反應？
3樓：匿名使用者
在94度時，所有雙鏈都是解離狀態，自由碰撞。由於溫度過高，及時互補鏈相遇，也無法形成氫鍵。
當溫度向55度降低時，互補鍊形成氫鍵的機率逐漸增大，由於引物的濃度大大超過以擴增的互補鏈，所以引物和互補鏈的結合開始增多，溫度降低到引物的tm溫度時，理論上已經有一般的互補鏈已經和引物結合了。降到55度時，結合基本完成，taq酶也到位。
溫度升到72度後，taq獲得最適溫度，活性增高，開始合成新鏈。再次升高溫度時，根據模板的長短，如果是原始的模板，taq酶還正在合成新鏈，合成被打斷。如果模板是新合成的，比較短，這時taq已經到了新合成連的末端，並且給末端加了個核苷酸-a.
這個也就是為什麼pcr產物其實是粘性末端：
************-a
a-************
上面一條是5『-3』，下面是互補 （示意圖）
4樓：匿名使用者
94度是變性溫度，在這個溫度下dna雙鏈開啟，72度是延伸溫度，這個溫度是dna聚合酶進行延伸的溫度，不一定延伸溫度都是72度，不同**的聚合酶延伸溫度不同，這兩個溫度基本都是由使用的聚合酶決定的，55度是退火溫度，是由你設計的引物決定的，在這個溫度下你的引物可以跟模版鏈特異性結合，一圈完整的pcr反應應該是94度變性，dna雙鏈開啟，55度退火，上下游引物分別與你的模板鏈特異性結合，最後是72度延伸，以模板鏈為複製模板，按照5'到3'的方向從引物的3'端開始往後延伸
5樓：
94℃時dna雙鏈發生解鏈，55℃時引物與模板dna鏈結合，72℃時結合了模板鏈的引物以其互補鏈為模板進行延伸。
之間是什麼意思？指降溫的過程？降溫是在很短的時間內完成的，中間的反應幾乎可以忽略不計。
影響pcr反應效率的因素有哪些？如何有效地提高pcr反應的效率？
6樓：閉曄旅爾容
一、溫度迴圈引數
二、引物引物設計
三、dna聚合酶
四、mg2+
如何確定pcr反應中的退火溫度和延長時間
7樓：禾鳥
1、退火溫度低於引物tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的tm值（tm值=4(g+c) +2(a+t)）為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對pcr的特異性有較大影響。
引物延伸一般在72℃進行（taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。
擴充套件資料
pcr的過程：
1、dna變性：（90℃-96℃）：雙鏈dna模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈dna
2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與dna模板結合，形成區域性雙鏈。
3、延伸：（70℃-75℃）：在taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dntp為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的dna鏈。
8樓：匿名使用者
退火溫度一般是比你設計引物時的tm值低5度。不過這是要摸索的，用溫度梯度pcr。（順便說一下，如果你不想花時間摸索溫度，建議就用60度。
這個溫度是我原來做實驗時的萬能溫度。尤其對較短片段pcr適用）
延長時間是看pcr產物長度，一般認為常規taq酶一分鐘擴增1kb。比如你的pcr產物是500bp，你就用30秒。不過我一般會在這個基礎上再加5秒左右。
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